两点一线 探寻细胞生命的“年轻因子”

2019-04-09 15:51:00 来源: 科技日报

在对生命本源的幻想中,人们总是前往隐秘之处寻找“不老泉”,而事实上,生命不老的秘密或许在它最小的单位中。

3月26日,我国科学家首次鉴定出使衰老间充质干细胞重获活力的“年轻因子”——多梳蛋白4(CBX4),并对其功能进行了验证,相关研究成果发布于《细胞报道》上。

几天后的4月1日,《公共科学图书馆·生物学》发表了同一科学家团队的另一个全新发现,首次在人间充质干细胞中确立了“年轻通路”——YAP-FOXD1,并证明该通路的激活可减轻细胞衰老及骨关节炎。

如果说前者是科学家团队在干细胞中发现了“不老泉眼”,那么后者的研究则是“两点一线”地确定了细胞生命的“青春之河”。

“该研究揭示了YAP-FOXD1通路在人干细胞去衰老及骨关节炎基因治疗中的作用与分子机制。”论文通讯作者之一、中国科学院生物物理研究所研究员刘光慧介绍,研究由中科院生物物理所刘光慧研究组同北京大学汤富酬研究组、中科院动物所曲静研究组合作完成,研究团队历经五年的努力从纵横交织的细胞基因调控网络中,证明了YAP-FOXD1通路的存在,并通过细胞和动物水平的实验证明了它的功能。

为癌基因“正名” YAP蛋白充当“年轻因子”

YAP-FOXD1通路中最先撞入科学家视野的是YAP蛋白。网上搜索YAP蛋白的“简历”,可以发现,与它关系最密切的是一条被业内称为“河马通路”的Hippo信号通路。

“河马通路”的上游一旦接收到抑制生长的信号,经过一系列激酶磷酸化反应后,最终以磷酸化的形式作用于下游效应因子YAP蛋白,决定YAP蛋白的磷酸化与否。

如果不被磷酸化,没有磷酸化基团“尾巴”的拖累,YAP便能够轻易进入细胞核,进入基因调控的大本营。这时YAP扮演的是“传令官”,它在大本营里的出现引来基因的活跃,它会选择与自己的靶基因结合,“传令下去”,催促靶基因表达出相应的RNA和蛋白质,从而影响细胞的生命活动。

“我们首先找到了YAP,它是一个功能明确的转录辅助激活因子。”刘光慧说,在细胞核里YAP可以和它的转录因子“伙伴”TEAD结合,共同激活下游靶基因的转录。

YAP如果带上了磷酸化基团的“尾巴”,就会被阻滞留在细胞质中,YAP无法到细胞核中“传令”,下游基因的转录表达受到抑制,细胞增殖也会受到抑制。

有报道指出,如果YAP进行频繁“传令”、不受节制,将会让细胞无限制增殖,进而可能引发肿瘤,因此被认为是一种“癌基因”。

YAP的特性给了研究团队两个任务:一是从功能上证明,它的存在与否是否与细胞的“年轻态”相关;二是它如何把“命令”传递下去进而调控功能基因的功能呢?它的“接令员”是谁,之前有没有被其他科学家找到呢?

为回答第一个问题,团队从正反两个角度进行验证。“我们通过CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术,发现了一系列可以延缓人类间充质干细胞衰老的蛋白。这些蛋白敲除后细胞会出现加速衰老的表型。”论文第一作者、中国科学院生物物理研究所博士生付丽娜说,基因敲除的工作开始于人胚胎干细胞,通过导入3种不同质粒,研究团队让人干细胞基因组中负责编码YAP蛋白的那段基因发生缺失。

“敲除的基因组DNA大概是几千个碱基,虽然敲除几个碱基也可能使得YAP因子失去功能,但是很可能导致新的异常蛋白的产生,从而引入无法排除的因素。”付丽娜说。团队必须确保YAP基因的完全沉默。为此,他们对CRISPR/Cas9基因编辑技术进行了改良,使其能够对巨大的YAP基因位点进行较大片段的删除。

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,团队获得了YAP特异性敲除的人胚胎干细胞,通过定向分化技术,将人胚胎干细胞定向诱导分化为间充质干细胞。“YAP缺失的人间充质干细胞表现出严重的加速衰老表型。”刘光慧说,YAP在维持人成体干细胞年轻态中发挥着关键作用,虽然YAP在某些肿瘤细胞中被证明具有“癌基因”的功能,但在人间充质细胞中却扮演着“年轻因子”的角色。

全新的“两点一线” 找到YAP蛋白“铁杆伙伴”和“接令员”

YAP通过与转录因子TEAD的相互作用来启动下游基因的转录,也就是说TEAD和YAP是“铁杆伙伴”。此前研究发现,YAP和TEAD通过YAP的N末端和TEAD的C末端间相互作用形成蛋白复合物,该蛋白复合物在YAP介导的细胞增殖中发挥着关键性的作用。

团队的第二个任务是寻找YAP的“接令员”。“我们假设YAP的某个或某些靶基因介导了人间充质干细胞年轻态的调节。”刘光慧说,“通过系列实验,我们发现YAP可以转录激活FOXD1,这是一个新型的YAP靶基因,之前从未被报道过。”

叉头框(FOX)蛋白家族包含50多个转录因子,在胚胎发育、细胞周期调控、糖类和脂类代谢、衰老调节等多种生物学过程中发挥作用。FOXD1是其中一个转录因子。付丽娜解释,之前有报道指出FOXD1能调节器官发育,并具有促进细胞增殖和细胞重编程的活性。

“我们首先对YAP敲除的人间充质干细胞进行了RNA测序,进一步结合转录因子结合元件的预测,我们推断FOXD1可能是YAP的一个新型靶基因。”付丽娜说,随后,为了验证推断,团队利用染色质免疫沉淀(ChIP)方法“钓”出能够特异性地结合FOXD1启动子DNA的蛋白(即YAP),最终证明是FOXD1从YAP处接过“命令”,开启调节细胞“年轻化”的分子程序。

“YAP是上游,FOXD1是下游。它们是一对命运共同体。”刘光慧解释,随着细胞衰老,YAP和FOXD1的表达都发生了一致性下调。

或助力基因治疗 未来可有效干预衰老相关疾病

从干细胞出发,发现机制机理,再回到细胞、生命体验证,“青春之河”的发现必须在生物体中证明自己的“魔力”。

“我们在三种细胞衰老模型中证明了YAP-FOXD1通路的去衰老作用,YAP或FOXD1的过表达能使衰老的人间充质干细胞重新获得增殖能力。”付丽娜说。另一方面,细胞实验的结果提示了过表达YAP或FOXD1可能使衰老的动物间充质组织(如关节)变得更加年轻。

团队接下来在动物身上实施了基因治疗。“我们在小鼠体内证明了YAP或FOXD1蛋白的过表达作为骨关节炎基因治疗方案的可行性和有效性。”刘光慧说,团队以慢病毒载体为基因导入媒介,将编码YAP或FOXD1蛋白的慢病毒注射到患有骨关节炎的小鼠的关节腔内。数周的YAP或FOXD1基因治疗均可显著降低关节软骨中衰老细胞的比例,有效抑制关节软骨退化及关节腔炎症,从多个方面改善骨关节炎的病理表型。

骨关节炎是典型的与细胞衰老关系密切的人类疾病。这些研究结果均证明,通过基因导入干细胞“年轻因子”,有望在未来治疗以骨关节炎为代表的衰老相关疾病。找对“不老泉眼”或者“青春之河”,将为基因治疗提供明确的标靶,最终对衰老相关疾病的干预提供有效的解决方案,并进行临床应用。(张佳星)

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